￥1380

植物总RNA提取试剂盒

（离心柱型）

目录号：GF2502

产品内容

储存条件

“裂解液RS”和“DNase I”储存于-20℃，其他试剂室温（15-25℃）保存；

加入巯基乙醇的裂解液RL需4℃保存；

自备试剂

β-巯基乙醇、无水乙醇

产品简介

由于植物的细胞结构和代谢活性在物种、组织类型和发育阶段之间可能存在显著差异，因此没有一种通用的裂解溶液或独特的方法可以同样适用于所有植物样品。本试剂盒包含两种可供选择的裂解缓冲液系统：裂解缓冲液RL（含硫氰酸胍）和裂解缓冲液RS(含SDS/抗氧化剂)，适用于各种植物和真菌样品。

“裂解液RL”含硫氰酸胍，此提取方案适用于大部分的植物组织，操作简单快速，但它不适用于富含淀粉、多酚类及多糖类的样本，因为裂解液RL加入上述样本后，会使样本变非常粘稠甚至凝固。

“裂解液RS”，采用我司独特的“SDS/抗氧化”的方式，可适用于广泛的植物组织，包含草本植物与本本植物的叶片、种子胚乳，特别是从富含多糖多酚或淀粉的植物组织（如棉花叶片，成熟水稻叶片，拟南芥种子，白松松针，香蕉，枇杷叶片，马铃薯块茎，苹果，梨，西瓜果肉，猕猴桃，月季，烟草，沙棘，百合等）中提取总RNA，此提取方案，增加了额外步骤去除多酚和多糖，RNA的提取总量更高。

本试剂盒提取的总RNA纯度高，基本没有基因组、蛋白和其它杂质的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。

预防RNase污染，应注意以下几方面

1.经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3.RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4.配制溶液应使用无RNase水（将水加到洁净玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(V/V)，放置过夜，高压灭菌）。

使用前注意事项

1.裂解液RL：使用前请添加300μl巯基乙醇，添加过巯基乙醇的裂解液4℃保存。

2.裂解液RS：使用前请于50℃水浴将裂解液完全回溶，并添加450μl巯基乙醇；添加过巯基乙醇的裂解液RS继续保存于-20℃。

3.溶液BC：使用前请添加30ml无水乙醇。

4.漂洗液PW：使用前请向添加60ml无水乙醇。

5.为确保RNA的品质及产量，应尽量收取新鲜的植物组织进行RNA提取，或将组织立即以液氮冷冻，储存于-70℃，组织亦可保存在RANstore样本保存液（目录号：GF2538）中。样本保存在RNAstore试剂中，可于37℃存放1天、4℃存放1个月、-20℃永久保存，所提取的RNA品质与储存在液氮中相同。

操作步骤

一、裂解液RL操作步骤：

1.匀浆处理

50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀，并于56℃孵育3min。

注意1：在56℃孵育1-3min将有助于植物组织裂解，但是对于某些富含淀粉的样品，请不要加热处理，防止因淀粉引起的样品膨胀现象。

注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。

2.将所有溶液转移至过滤柱CS1上(过滤柱CS1放在收集管中)，12,000rpm(~13,400×g)离心2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

注意：由于裂解液较粘稠，所以将溶液转移至过滤柱时，可以剪去部分吸头末端。

3.缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。

4.将所得“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀），移取至吸附柱CR1中（吸附柱CR1放入收集管中），12,000rpm (~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。

注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱CR1时，如果体积大于吸附柱容量，可以分次完成。

5.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心离心1min，丢弃滤液,将吸附柱CR1放回收集管中。

6.DNaseⅠ工作液的配制：取10μl DNaseⅠ放入新的RNase-Free离心管中，加入80μl Buffer RDD（DNA消化缓冲液），轻柔混匀。

7.向吸附柱CR1中央加入90μl “DNaseⅠ工作液”，室温放置15 min。

8.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。

9.向吸附柱CR1中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。

10.重复操作步骤9。

11.12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的乙醇。

注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。

12.将吸附柱CR1转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-100μl无酶双蒸水至吸附柱的膜中心，室温静置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率；RNA溶液请于-70℃保存。

二、裂解液RS操作步骤

1.匀浆处理：50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μl裂解液RS（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），立即涡旋剧烈震荡混匀，并于56℃孵育5-10min，每隔一段时间可翻转混合离心管。

注意：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。

2.加入150μl的溶液GP至裂解液中，混合均匀，于冰上孵育5min，12,000rpm(~13,400×g)离心5min。

注意：溶液会呈现雾状，为界面活性剂、蛋白质、多糖及二次代谢物的沉淀物。

3.移取上清液至过滤柱CS1上(过滤柱CS1放在收集管中)，12,000rpm(~13,400×g)离心2min。

4.小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

5.向溶液中加入1.5倍体积的溶液BC（使用前请检查是否已添加无水乙醇）,以震荡或移液器吸吐混合均匀。

注意：加入溶液BC后会形成丝状沉淀物，不影响RNA提取。

6.移取混合液（连同沉淀物一起）至吸附柱CR1（吸附柱CR1放在收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，丢弃滤液，将吸附柱CR1放回收集管中。

注意：如果混合液体积大于吸附柱容量，可以分次完成。

7.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，丢弃滤液，将吸附柱CR1放回收集管中。

8.DNaseⅠ工作液的配制：取10μl DNaseⅠ放入新的RNase-Free离心管中，加入80μl Buffer RDD（DNA消化缓冲液），轻柔混匀。

9.向吸附柱CR1中央加入90μl “DNaseⅠ工作液”，室温放置15 min。

10.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。

11.向吸附柱CR1中加入600μl漂洗液PW（使用前请检查是否已加入乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，丢弃滤液，将吸附柱CR1放回收集管中。

12.重复操作步骤11。

13.12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的乙醇。

注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。

14.将吸附柱CR1转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-100μl无酶双蒸水至吸附柱的膜中心，室温静置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

注意：洗脱液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。为了增加产量，可将步骤13得到的RNA溶液再加入吸附柱CR1，放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。RNA溶液-70℃中保存。

附录：从高度黏稠性的富含多酚及多糖成分的样本中提取RNA

樟科植物样本，在裂解后粘稠度高、移取困难，可直接于过滤柱中进行裂解，以减少移液器吸取的步骤。

1.将过滤柱CS1于冰上预冷，秤取不超过30mg的样本组织，于液氮中迅速研磨，并将研磨的样本直接转移至预冷的过滤柱CS1里（过滤柱CS1放在收集管中）。

2.加入600μl裂解液RS(已添加巯基乙醇)至过滤柱，于60℃金属浴孵育10min。

3.12,000rpm(~13,400×g)离心5min，将收集管中的滤液移取至新的1.5ml离心管，请避免吸取到沉物。

注意：有些样本可能会堵塞过滤柱，可再次离心，或将管柱中剩余的裂解液移至新的过滤柱CS1再次离心。

4.加入1/3倍体积的溶液GP至滤液中，混合均匀，于冰上孵育5min，12,000rpm(~13,400×g)离心5min,将上清液小心转移至新的1.5ml离心管，不要触碰或移取固体沉淀。转至上面“操作步骤 二/5”。

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