￥1180

总RNA提取试剂盒

（离心柱型） / 目录号：GF2501

产品内容

选配的试剂

蛋白酶K（20 mg/ml）目录号：GF0202-01，客户自备，提取动物组织总RNA时需配备；

溶菌酶（50 mg/ml）目录号：GF0203-01，客户自备，提取细菌总RNA时需配备。

自备试剂

β-巯基乙醇、无水乙醇

储存条件

DNase I 储存于-20℃；其他试剂室温（15-25℃）保存；加入巯基乙醇的裂解液RL需4℃保存；

产品简介

总RNA提取试剂盒提供了快速简单且有效的方法，可从各种动物组织、培养细胞及细菌、植物组织、中提取总RNA。本试剂盒采用离心管柱的方式，配合使用我司独特的硫氰酸胍裂解液，使组织或细胞裂解及均质化，并加入乙醇使RNA选择性的与管柱膜结合，于操作过程中加入DNase Ⅰ以去除残留的基因组DNA，经过多次“洗涤及离心”的步骤去除污染杂质，再以无核酸酶水回收结合在管柱膜上的RNA。若RNA小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,无法在此系统中被有效地回收。提取的总RNA纯度高，基本没有DNA和蛋白质污染，可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。

本试剂盒适用于心脏、肌肉和皮肤等纤维组织提取总RNA;

本试剂盒同样适用酵母，可以从酵母菌中提取总RNA,具体操作方法见“附录Ⅰ”;

本试剂盒也可用于将以其他方法提取的RAN进行clean up或去除基因组DNA污染，详见“附录Ⅱ”。

预防RNase污染，应注意以下几方面

1.经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3.RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4.配制溶液应使用无RNase水（将水加到洁净玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(V/V)，放置过夜，高压灭菌）。

使用前注意事项

1.裂解液RL：使用前请添加300μl巯基乙醇，添加过巯基乙醇的裂解液4℃保存。

2.漂洗液PW：使用前请添加60ml无水乙醇。

3.为确保RNA的品质及产量，应尽量收取新鲜的动物组织进行RNA提取，或将组织立即以液氮冷冻，储存于-70℃，组织亦可保存在RANstore样本保存液（目录号：GF2538）中。样本保存在RNAstore试剂中，可于37℃存放1天、4℃存放1个月、-20℃永久保存，所提取的RNA品质与储存在液氮中相同。

操作步骤

一、从培养细胞中提取总RNA

1.收集细胞

a.悬浮细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：估计细胞数量，300×g离心5min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。

b.单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过10cm），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。）

Ø  直接裂解法：确定细胞数量，彻底吸除细胞培养基上清，立即进行第2步裂解步骤。

Ø  胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。

注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，造成RNA的产量降低;请勿使用过多的样本量，避免管柱杜塞而造成RNA的产量降低。

2.裂解处理

a.对于离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RL（详见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），旋涡震荡混匀。

b.对于直接裂解的细胞：加入适量裂解液RL（详见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），将细胞裂解液转移至离心管中，涡旋震荡混匀。

3.将所有溶液转至过滤柱CS1上(过滤柱CS1放在收集管中)，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，收集滤液。

4.向滤液加入等体积70%乙醇至裂解液中，混匀（此时可能会出现沉淀），转至后面“RNA提取步骤”。

二、从动物组织中提取总RNA

本试剂盒同样适用对于纤维组织（如心脏、肌肉和皮肤）RNA的提取;

1.匀浆处理：

每10-20mg组织加300μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用研磨杵将组织彻底研磨（如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器）；随后向匀浆液 中加入590μl RNase-Free ddH₂O和10μl Proteinase K（20mg/ml），混匀后56℃处理10-20min。

注意：组织量一定不要超过20mg，否则将导致RNA得率和质量下降。

2.将裂解混合液转移至过滤柱CS1(过滤柱CS1放入收集管中)，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，收集滤液。

3.向滤液加入0.5倍上清体积的无水乙醇，均匀（此时可能会出现沉淀），转至后面“RNA提取步骤”。

三、从细菌中提取总RNA

1.4℃ 12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集菌体（收集菌体的最大量不超过1×10⁹），仔细去除所有培养基上清，以后的所有离心步骤均在室温（20-25℃）进行。

注意：如果培养基上清去除不完全，将对第二步中的细胞壁消化过程产生抑制。

2.用含有溶菌酶的100μl TE缓冲液（客户自己配制，配制方法见下表）彻底重悬菌体，孵育时间见下表。

3.加入350μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀。

4.将裂解混合液转至过滤柱CS1上(过滤柱CS1放入收集管)，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，收集滤液。

5.向滤液中加入250μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），转至后面“RNA提取步骤”。

四、从植物组织中提取总RNA

本试剂盒不适用于富含淀粉、酚类和次级代谢物的植物组织（例如一些木本植物，胚乳或丝状真菌的菌丝体），因为“裂解液RL”在加入至样本粉末后，会变固态或非常粘稠,此类植物组织请使用“植物总RNA提取试剂盒”（货号GF2502）。

1.匀浆处理

50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀，并于56℃孵育3分钟。

注意1：在56℃孵育1-3min将有助于植物组织裂解，但是对于某些富含淀粉的样品，请不要加热处理，防止因淀粉引起的样品膨胀现象。

注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。

2.将所有溶液转移至过滤柱CS1上(过滤柱CS1放在收集管中)，12,000rpm(~13,400×g)离心2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

注意：由于裂解液较粘稠，所以将溶液转移至过滤柱时，可以剪去部分吸头末端。

3.缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），转至“RNA提取步骤”。

RNA提取步骤

此为续接样本制备“一、二、三、四”后的RNA提取操作步骤。

1.将前一步所得“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀），移取至吸附柱CR1中（吸附柱CR1放入收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。

注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱CR1时，如果体积大于吸附柱容量，可以分次完成。

2.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心离心1min，丢弃滤液，将吸附柱CR1放回收集管中。

3.DNaseⅠ工作液的配制：取10μl DNaseⅠ放入新的RNase-Free离心管中，加入80μl Buffer RDD（DNA消化缓冲液），轻柔混匀。

4.向吸附柱CR1中央加入90μl “DNaseⅠ工作液”，室温放置15 min。

5.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。

6.向吸附柱CR1中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。

7.重复操作步骤6。

8.12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的乙醇。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，以免影响后续的实验。

9.将吸附柱CR1转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-100μl无酶双蒸水至吸附柱的膜中心，室温静置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率；RNA溶液请于-70℃保存。

附录Ⅰ：从酵母菌中提取总RNA

一、需要自备的试剂：

a.溶壁酶（Lyticase）：目录号GF0210-01

b.山梨醇 buffer：

用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)配制1.2M 山梨醇;

0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)的配制：77.4ml 0.1mol/L Na₂HPO₄+ 22.6ml 0.1mol/L NaH₂PO₄

二、操作步骤

1.取酵母细胞（最多不超过5×10⁷cells），12,000 rpm(~13,400×g)离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2.酵母细胞壁的破除：

酶法：向菌体中加入1ml山梨醇buffer，加入大约50U Lyticase（需自备，我司目录号：GF0210-01）充分混匀，30℃孵育30min，300×g离心5min，弃上清，收集沉淀。

注意：以上为5×10⁷酵母细胞的Lyticase用量，根据酵母的菌株和酵母细胞数量的不同，所用Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。

3.加入350μl裂解液RL（在使用前请加入β-巯基乙醇），涡旋振荡混匀，将裂解混合液转移至过滤柱CS1上(过滤柱CS1放入收集管中)，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，收集滤液。

4.向滤液中加入350μl 70%乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），转至上面“RNA提取步骤”。

附录Ⅱ：RNA Clean -Up或基因组DNA去除。

本试剂盒可用于将以其他方法提取的RAN进行clean up或去除基因组DNA污染。

1.将RNA以无酶水调整体积至100μl，加入350μl的裂解液RL（使用前请加入β巯基乙醇），混合均匀。

2.加入250μl的无水乙醇至裂解液中，混匀，转至上面“RNA提取步骤”。

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