说明书下载动物组织总RNA提取试剂盒
（离心柱型） / 目录号：GF2431
产品内容
|
产品组成 |
GF2431 / (50 preps) |
|
裂解液RL (Buffer RL) |
30ml（使用前加入300μl的巯基乙醇） |
|
溶液RW (Buffer RW ) |
55ml |
|
DNase I (4U/10ul) |
600μl |
|
DNA消化缓冲液 (Buffer RDD) |
5ml |
|
漂洗液PW (Buffer PW) |
15ml（使用前加入60ml无水乙醇） |
|
无酶双蒸水(RNase-Free ddH2O) |
45ml |
|
无酶离心管(RNase-Free Centrifuge Tubes 1.5ml) |
50个 |
|
无酶过滤柱CS1(Filtration Columns CS1) |
50套 |
|
无酶吸附柱CR1(Spin Columns CR1) |
50套 |
选配的试剂
蛋白酶K（20 mg/ml）目录号：GF0202-01，客户自备，提取动物组织总RNA时需配备；
溶菌酶（50 mg/ml）目录号：GF0203-01，客户自备，提取细菌总RNA时需配备。
自备试剂
β-巯基乙醇、无水乙醇
储存条件
DNase I 储存于-20℃；其他试剂室温（15-25℃）保存；加入巯基乙醇的裂解液RL需4℃保存；
产品简介
动物组织总RNA提取试剂盒提供了快速简单且有效的方法，可从各种动物组织样本中提取总RNA。本试剂盒采用离心管柱的方式，配合使用我司独特的硫氰酸胍裂解液，使组织样本裂解及均质化，并加入乙醇使RNA选择性的与管柱膜结合，于操作过程中加入DNase Ⅰ以去除残留的基因组DNA，经过多次“洗涤及离心”的步骤去除污染杂质，再以无核酸酶水回收结合在管柱膜上的RNA。若RNA小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,无法在此系统中被有效地回收。提取的组织总RNA纯度高，基本没有DNA和蛋白质污染，可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。
预防RNase污染，应注意以下几方面
1.经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3.RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase水（将水加到洁净玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(V/V)，放置过夜，高压灭菌）。
使用前注意事项
1.裂解液RL：使用前请添加300μl巯基乙醇，添加过巯基乙醇的裂解液4℃保存。
2.漂洗液PW：使用前请添加60ml无水乙醇。
3.为确保RNA的品质及产量，应尽量收取新鲜的动物组织进行RNA提取，或将组织立即以液氮冷冻，储存于-70℃，组织亦可保存在RANstore样本保存液（目录号：GF2538）中。样本保存在RNAstore试剂中，可于37℃存放1天、4℃存放1个月、-20℃永久保存，所提取的RNA品质与储存在液氮中相同。
操作步骤
1.匀浆处理：
每10-20mg组织加300μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用研磨杵将组织彻底研磨（如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器）；随后向匀浆液中加入590μlRNase-Free ddH2O和10μlProteinase K（20mg/ml），混匀后56℃处理10-20min。
注意：组织量一定不要超过20mg，否则将导致RNA得率和质量下降。
2.去除杂质：
将裂解混合液转移至过滤柱CS1(过滤柱CS1放入收集管中)，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，收集滤液。
3.RNA提取
向滤液加入0.5倍上清体积的无水乙醇，充分混匀（此时可能会出现沉淀），转至后面“RNA提取步骤”。
RNA提取步骤
此为续接组织样本制备后的RNA提取操作步骤。
1.将前一步所得“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀），移取至吸附柱CR1中（吸附柱CR1放入收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱CR1时，如果体积大于吸附柱容量，可以分次完成。
2.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，丢弃滤液，将吸附柱CR1放回收集管中。
3.DNaseⅠ工作液的配制：取10μlDNaseⅠ放入新的RNase-Free离心管中，加入80μlBuffer RDD（DNA消化缓冲液），轻柔混匀。
4.向吸附柱CR1中央加入90μl“DNaseⅠ工作液”，室温放置15 min。
5.向吸附柱CR1中加入500μl溶液RW，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
6.向吸附柱CR1中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
7.重复操作步骤6。
8.12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的乙醇。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，以免影响后续的实验。
9.将吸附柱CR1转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-100μl无酶双蒸水至吸附柱的膜中心，室温静置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率；RNA溶液请于-70℃保存。
RNA纯度及浓度检测
完整性： RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲 液；150V，15 min)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看 到非常明显的rRNA条带。28S rRNA的量约为18S rRNA的两倍，说明RNA的完整性较好。
纯度：OD260 /OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读 数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH值 影响。同一个RNA样品，假定在10 mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1之 间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-Free ddH2 O稀释n 倍，用RNase-FreeddH2 O将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40