说明书下载无内毒素质粒小提中量试剂盒
（离心柱型） / 目录号：GF2118
产品内容
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产品组成 |
GF2118 / (20 preps) |
GF2118 / (50 preps) |
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溶液P1 (Buffer P1) |
15 ml |
30 ml |
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溶液P2 (Buffer P2) |
15 ml |
30 ml |
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溶液P3 (Buffer P3) |
15 ml |
30 ml |
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去内毒素溶液ER (Endotoxin Removal Buffer ER) |
12 ml（使用前先加入8 ml 异丙醇） |
24 ml（使用前先加入16 ml 异丙醇） |
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漂洗液PW (Buffer PW) |
6 ml（使用前请先加入24 ml无水乙醇） |
15 ml（使用前请先加入60 ml无水乙醇） |
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洗脱缓冲液TB (Buffer TB) |
15 ml |
15 ml |
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RNase A (10 mg/ml) |
375 μl |
750 μl |
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过滤柱CS1 (Filtration Columns CS1) |
20个 |
50个 |
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吸附柱CP2 (Spin Columns CP2) |
20个 |
50个 |
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收集管(2 ml)(Collection Tubes 2 ml) |
40个 |
100个 |
储存条件
该试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀。第一次使用前将RNase A 加入溶液P1中，混匀后置于2-8℃保存，可稳定保存12个月。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月以上。
产品简介
本试剂盒采用新型核酸提取吸附柱，其核心在于采用经独特表面改性与孔径优化的纳米硅基微孔板，显著提升核酸吸附选择性与洗脱效率；同时采用特殊的去内毒素溶液ER和过滤柱CS1，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1个小时。以下操作步骤适用于提取5-15 ml过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。
本试剂盒提取的质粒DNA可用于转染多种细胞及各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接等实验。
提取得率
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质粒类型 |
菌液量 |
得率 |
质粒 |
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低拷贝 |
5-15 ml |
5-25 μg |
pBR322, pACYC及其衍生载体，pSC101及其衍生载体，SuperCos, pWE15 |
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高拷贝 |
5-15 ml |
15-70 μg |
pTZ, pUC, pBS, pGM-T |
注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
2.使用前先检查溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
3.所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm(~13,400×g )。
4.去内毒素溶液ER在多次开盖使用后，可能会有细微的颜色变化，不影响最终质粒提取效率和纯度。
5.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
操作步骤
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1.取5-15 ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心1 min，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器吸吐或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3.向离心管中加入500 μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4.向离心管中加入500 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10 min左右，12,000 rpm(~13,400×g)离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有白色沉淀，可再次离心后取上清。
6.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS1（过滤柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，小心地将过滤离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP2中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体，说明步骤4的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清）。
7.将上一步收集的上清液用移液器分次转移到吸附柱CP2中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP2放入收集管中。
8.向吸附柱CP2加入750 μl去内毒素溶液ER（请检查是否已加入异丙醇），静置2 min使管柱膜平衡，室温12,000rpm (~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9.向吸附柱CP2中加入700 μl漂洗液PW（请检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP2放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
10.重复操作步骤9。
11.将吸附柱CP2重新放回收集管，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，目的是去除吸附柱中残余漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇
的影响，建议将吸附柱CP2开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。
12.将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心1 min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于100 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。