说明书下载无内毒素质粒大提试剂盒
（离心柱型） / 目录号：GF2120
产品内容
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产品组成 |
GF2120 / (2 preps) |
GF2120 / (10 preps) |
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平衡液BL（Buffer BL） |
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30 ml |
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溶液P1 (Buffer P1) |
30 ml |
120 ml |
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溶液P2 (Buffer P2) |
30 ml |
120 ml |
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溶液P3 (Buffer P3) |
30 ml |
120 ml |
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去内毒素溶液ER (Endotoxin Removal Buffer ER) |
12 ml(使用前请先加入8 ml异丙醇) |
72 ml(使用前请先加入48 ml异丙醇) |
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漂洗液PW (Buffer PW) |
15 ml（使用前请先加入60ml无水乙醇） |
50ml（使用前请先加入200ml无水乙醇） |
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洗脱缓冲液TB (Buffer TB) |
15 ml |
30 ml |
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RNase A (10 mg/ml) |
750 μl |
1.5ml×2 |
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过滤器CS2 (Filtration CS2) |
2个 |
10个 |
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吸附柱CP4 (Spin Columns CP4) |
2个 |
10个 |
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收集管(50 ml) (Collection Tubes 50 ml) |
4个 |
20个 |
储存条件
该试剂盒在室温（15-25℃）干燥条件下可保存12个月；如需更长时间保存，可置于2-8℃。若2-8℃保存时产生沉淀，使用前于室温放置或37℃水浴预热10min溶解。首次使用前将RNase A加入溶液P1混匀，2-8℃可保存12个月；单独包装的RNase A在室温下可稳定保存12个月以上。
产品简介
本试剂盒采用经独特表面改性与孔径优化的纳米硅基微孔板吸附柱，显著提升了质粒DNA的吸附选择性与洗脱效率。同时采用去内毒素溶液和过滤器，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1h。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100 ml，得率一般在500-1500 μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200 ml，得率一般在200-600 μg左右。
注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
2.使用前先检查溶液P2和P3是否有结晶或者沉淀，如有，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
3.使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。
4.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加溶液P1、P2、P3的用量；洗脱缓冲液TB推荐在65-70℃水浴中预热。可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
5.去内毒素溶液ER在多次开盖使用后，可能会有细微的颜色变化，不影响最终质粒提取效率和纯度。
操作步骤
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1.吸附柱平衡：向吸附柱CP4中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5ml的平衡液BL，8,000rpm (~8,228×g)离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（用平衡液处理过的柱子最好立即使用）。
注：试用装可忽略本步骤。
2.取100 ml（根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200 ml）过夜培养的菌液加入离心管，室温8,000rpm(~8,228×g)离心3 min收集细菌，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加溶液P1、P2、P3的用量。
3.尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
4.向留有菌体沉淀的离心管中加入10 ml溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器吸吐或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加P1、P2、P3的用量。
5.向离心管中加入10 ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置2-4 min。
注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏；此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
6.向离心管中加入10 ml溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10 min左右。8,000 rpm(~8,228×g)离心5-10 min，使白色沉淀离心至管底（可适当增加离心时间），将全部溶液小心倒入过滤器CS2中（请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50 ml的管中（自备）。
注意：加入溶液P3后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS2中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多（ >100 ml），推荐延长离心时间至20-30 min。
7.将上一步收集到的滤液转移到吸附柱CP4中(吸附柱放入50 ml收集中)，室温8,000 rpm(~8,228×g)离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放回收集管中。
注意：吸附柱CP4的最大容积为15 ml，所以需要分2次过柱，每次均按以上条件操作。个别情况下离心机转子倾角较大，此时，建议加入吸附柱CP4的溶液体积不超过10 ml，以防产生漏液现象。
8.向吸附柱CP4中加入10 ml去内毒素溶液ER（请检查是否已加入异丙醇），静置2 min以平衡管柱膜，于8,000rpm (~8,228×g)离心1 min,丢弃滤液，将吸附柱CP4重新放回收集管中。
9.向吸附柱CP4中加入10 ml漂洗液PW(请检查是否已加入无水乙醇)，8,000 rpm(~8,228×g)离心2 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10.重复操作步骤9一次。
11.将吸附柱CP4重新放回收集管中，8,000rpm(~8,228×g)离心5 min，然后将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)实验。
12.将吸附柱CP4置于一个干净的50 ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2 ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8,000rpm(~8,228×g)离心5min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5 ml离心管，-20℃保存。
注意：洗脱缓冲液用量根据质粒拷贝数和所需浓度确定，洗脱体积不应少于1 ml，否则影响回收效率。洗脱液pH值对洗脱效率影响大，若用ddH₂O，需保证pH在7.5-8.0范围内（低于7.0会降低效率）。DNA产物应于-20℃保存以防降解。为提高回收率，可将所得溶液重新加入吸附柱，室温放置2 min，8,000 rpm (~8,228×g)离心2 min，收集质粒溶液。